Gracias por visitar www.chinacdoe.com.La versión del navegador que está utilizando tiene soporte CSS limitado.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador actualizado (o deshabilite el Modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, presentaremos el sitio sin estilos ni JavaScript.
Los sistemas de laboratorio en un chip con capacidades in situ ofrecen la posibilidad de realizar un diagnóstico rápido y preciso y son útiles en entornos con recursos limitados donde no se dispone de equipos biomédicos ni profesionales capacitados.Sin embargo, la creación de un sistema de pruebas en el punto de atención que tenga simultáneamente todas las características necesarias para la dispensación multifuncional, la liberación bajo demanda, el rendimiento confiable y el almacenamiento de reactivos a largo plazo sigue siendo un desafío importante.Aquí describimos una tecnología de microinterruptor de recorrido accionado por palanca que puede manipular fluidos en cualquier dirección, proporcionar una respuesta precisa y proporcional a la presión del aire aplicada y permanecer estable contra movimientos y vibraciones repentinos.Con base en la tecnología, también describimos el desarrollo de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa que integra las funciones de introducción, mezcla y reacción de reactivos, todo en un solo proceso, que logra un rendimiento de "muestra en respuesta y salida" para todas las muestras nasales clínicas de 18 pacientes con Influenza y 18 controles individuales, con buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la reacción en cadena de la polimerasa estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).Basándonos en la tecnología, también describimos el desarrollo de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa que integra las funciones de introducción, mezcla y reacción de reactivos, todo en un solo proceso, que logra un rendimiento de "muestra en respuesta" para todas las muestras nasales clínicas de 18 pacientes. con Influenza y 18 controles individuales, con buena concordancia de intensidad de fluorescencia con la reacción en cadena de la polimerasa estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).Основываясь на этой технологии, мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединяет введения реагентов, смешивания и реакции в одном процессе, что обеспечивает выполнение «образец-в-ответ-выход» для всех клиничес ких образцов из носа от 18 pacientes con Грипп и 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуорессенции со стандартной полимеразной цепной реакцией (коэ ффициенты Пирсона> 0,9).Con base en esta tecnología, también describimos el desarrollo de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa que combina las funciones de inyectar, mezclar y reaccionar en un solo proceso, lo que permite la toma de muestras en respuesta para todas las muestras nasales clínicas de 18 pacientes con influenza.y 18 controles individuales, en buena concordancia con la intensidad de fluorescencia de la reacción en cadena de la polimerasa estándar (coeficientes de Pearson> 0,9).Con base en esta tecnología, también describimos el desarrollo de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa que integra funciones de inyección, mezcla y reacción de reactivos para analizar todas las muestras nasales clínicas de 18 muestras de pacientes nasales en la muestra. Influenza y 18 controles individuales, intensidad de fluorescencia igualada bien con la reacción en cadena de la polimerasa estándar (coeficiente de Pearson > 0,9).La plataforma propuesta garantiza una automatización confiable del análisis biomédico y, por lo tanto, puede acelerar la comercialización de una variedad de dispositivos de prueba en el punto de atención.
Las enfermedades humanas emergentes, como la pandemia de COVID-19 de 2020 que se ha cobrado la vida de millones de personas, suponen una grave amenaza para la salud mundial y la civilización humana1.La detección temprana, rápida y precisa de enfermedades es fundamental para controlar la propagación del virus y mejorar los resultados del tratamiento.Un ecosistema de diagnóstico central basado en laboratorios centralizados donde las muestras de prueba se envían a hospitales o clínicas de diagnóstico y son administrados por profesionales está restringiendo actualmente el acceso a casi 5.800 millones de personas en todo el mundo, especialmente aquellos que viven en entornos con recursos limitados.donde faltan equipos biomédicos costosos y especialistas calificados.médicos 2. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un sistema de laboratorio en un chip económico y fácil de usar con capacidad de pruebas en el punto de atención (POCT) que pueda proporcionar a los médicos información de diagnóstico oportuna para tomar decisiones de diagnóstico informadas. .y tratamiento 3.
Las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) establecen que un POCT ideal debe ser asequible, fácil de usar (fácil de usar con una formación mínima), preciso (evitar falsos negativos o falsos positivos), rápido y fiable (proporcionar buenas propiedades de repetibilidad) y entregable (capaz de almacenamiento a largo plazo y fácilmente disponible para los usuarios finales)4.Para cumplir con estos requisitos, los sistemas POCT deben proporcionar las siguientes características: dosificación versátil para reducir la intervención manual, liberación a pedido, transporte de reactivos a escala para obtener resultados de prueba precisos y rendimiento confiable para resistir la vibración ambiental.Actualmente, el dispositivo POCT más utilizado es la tira de flujo lateral5,6 que consta de varias capas de membranas porosas de nitrocelulosa que empujan una cantidad muy pequeña de muestra hacia adelante, reaccionando con reactivos preinmovilizados por fuerza capilar.Aunque tienen la ventaja de su bajo costo, facilidad de uso y resultados rápidos, los dispositivos POCT basados en tiras de flujo solo pueden usarse para pruebas biológicas (p. ej., pruebas de glucosa7,8 y pruebas de embarazo9,10) sin requerir análisis de múltiples etapas.reacciones (por ejemplo, carga de múltiples reactivos, mezcla, multiplexación).Además, las fuerzas impulsoras que controlan el movimiento del fluido (es decir, fuerzas capilares) no proporcionan una buena consistencia, especialmente entre lotes, lo que resulta en una reproducibilidad deficiente11 y hace que las bandas de flujo lateral sean principalmente útiles para una buena detección12,13.
Las capacidades de fabricación ampliadas a micro y nanoescala han creado oportunidades para el desarrollo de dispositivos POCT de microfluidos para mediciones cuantitativas14,15,16,17.Ajustando las propiedades de la interfaz 18, 19 y la geometría de los canales 20, 21, 22, se puede controlar la fuerza capilar y el caudal de estos dispositivos.Sin embargo, su confiabilidad, especialmente para líquidos altamente humedecidos, sigue siendo inaceptable debido a imprecisiones de fabricación, defectos de materiales y sensibilidad a las vibraciones ambientales.Además, dado que se crea un flujo capilar en la interfaz líquido-gas, no se puede introducir ningún flujo adicional, especialmente después de llenar el canal de microfluidos con líquido.Por lo tanto, para una detección más compleja, se deben realizar varios pasos de inyección de muestra24,25.
Entre los dispositivos de microfluidos, los dispositivos de microfluidos centrífugos son actualmente una de las mejores soluciones para POCT26,27.Su mecanismo de accionamiento es ventajoso porque la fuerza motriz se puede controlar ajustando la velocidad de rotación.Sin embargo, la desventaja es que la fuerza centrífuga siempre se dirige hacia el borde exterior del dispositivo, lo que dificulta la implementación de reacciones de varios pasos necesarias para análisis más complejos.Aunque para la dosificación multifuncional se introducen fuerzas impulsoras adicionales (por ejemplo, capilares 28, 29 y muchos otros 30, 31, 32, 33, 34, 35) además de la fuerza centrífuga, todavía puede producirse una transferencia de líquido imprevista porque estas fuerzas adicionales son generalmente órdenes de magnitud menor que la fuerza centrífuga, lo que los hace solo efectivos en rangos operativos pequeños o no disponibles bajo demanda con liberación de líquido.La incorporación de manipulaciones neumáticas en microfluidos centrífugos, como los métodos cinéticos centrífugos 36, 37, 38, los métodos termoneumáticos 39 y los métodos neumáticos activos 40, ha demostrado ser una alternativa atractiva.Con el enfoque contrafugodinámico, se integran en el dispositivo una cavidad adicional y microcanales de conexión para acción tanto externa como interna, aunque su eficiencia de bombeo (en el rango del 75% al 90%) depende en gran medida del número de ciclos de bombeo y de la viscosidad. del líquido.En el método termoneumático, la membrana de látex y la cámara de transferencia de fluido están diseñadas específicamente para sellar o reabrir la entrada cuando el volumen de aire atrapado se calienta o enfría.Sin embargo, la configuración de calentamiento/enfriamiento introduce problemas de respuesta lenta y limita su uso en ensayos termosensibles (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)).Con un enfoque neumático activo, la liberación según demanda y el movimiento hacia adentro se logran mediante la aplicación simultánea de presión positiva y velocidades de rotación exactamente iguales mediante motores de alta velocidad.Existen otros enfoques exitosos que utilizan únicamente actuadores neumáticos (presión positiva 41, 42 o presión negativa 43) y diseños de válvulas normalmente cerradas.Al aplicar presión sucesivamente en la cámara neumática, el líquido se bombea hacia adelante peristálticamente y la válvula normalmente cerrada evita el reflujo de líquido debido a la peristalsis, realizando así operaciones complejas con líquidos.Sin embargo, actualmente solo existe un número limitado de tecnologías de microfluidos que pueden realizar operaciones líquidas complejas en un solo dispositivo POCT, incluida la dispensación multifuncional, la liberación bajo demanda, el rendimiento confiable, el almacenamiento a largo plazo, el manejo de líquidos de alta viscosidad, y fabricación rentable.Todo al mismo tiempo.La falta de una operación funcional de varios pasos también puede ser una de las razones por las que hasta la fecha sólo se han introducido con éxito en el mercado abierto unos pocos productos POCT comerciales, como Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat y Rhonda.
En este artículo, proponemos un actuador microfluídico neumático basado en la tecnología de microinterruptor de anillo verde (FAST).FAST combina todas las propiedades necesarias al mismo tiempo para una amplia gama de reactivos desde microlitros hasta mililitros.FAST consta de membranas elásticas, palancas y bloques.Sin la aplicación de presión de aire, las membranas, palancas y bloques se pueden cerrar herméticamente y el líquido del interior se puede almacenar durante mucho tiempo.Cuando se aplica la presión adecuada y se ajusta a la longitud de la palanca, el diafragma se expande y empuja la palanca a la posición abierta, permitiendo el paso del fluido.Esto permite una dosificación multifuncional de líquidos en cascada, simultánea, secuencial o selectiva.
Hemos desarrollado un sistema de PCR utilizando FAST para generar resultados de respuesta en muestra para la detección de los virus de la influenza A y B (IAV e IBV).Logramos un límite inferior de detección (LOD) de 102 copias/ml, nuestro ensayo múltiplex mostró especificidad para IAV e IBV y permitió la patotipificación del virus de la influenza.Los resultados de las pruebas clínicas que utilizan muestras de hisopos nasales de 18 pacientes y 18 individuos sanos muestran una buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).Los resultados de las pruebas clínicas que utilizan muestras de hisopos nasales de 18 pacientes y 18 individuos sanos muestran una buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).Respuestas a las preguntas clínicas con la aplicación de mascarillas para 18 pacientes y 18 personas con menos tiempo соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэфифициенты Пирсона > 0,9).Los resultados de los ensayos clínicos que utilizaron una muestra de hisopo nasal de 18 pacientes y 18 individuos sanos muestran una buena concordancia entre la intensidad de fluorescencia de la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).0.9）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 pacientes y 18 здоровых лиц показали ее соответствие между интенсивностью флуорессенции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Los resultados de los ensayos clínicos que utilizaron muestras de hisopos nasales de 18 pacientes y 18 individuos sanos mostraron una buena concordancia entre la intensidad de la fluorescencia y la RT-PCR estándar (coeficiente de Pearson > 0,9).El costo de material estimado de un dispositivo FAST-POCT es de aproximadamente 1 dólar estadounidense (Tabla complementaria 1) y puede reducirse aún más mediante el uso de métodos de fabricación a gran escala (por ejemplo, moldeo por inyección).De hecho, los dispositivos POCT basados en FAST tienen todas las características necesarias exigidas por la OMS y son compatibles con nuevos métodos de pruebas bioquímicas, como el ciclo térmico del plasma44, los inmunoensayos sin amplificación45 y las pruebas de funcionalización de nanocuerpos46, que son la columna vertebral de los sistemas POCT.posibilidad.
En la fig.1a muestra la estructura de la plataforma FAST-POCT, que consta de cuatro cámaras de líquido: una cámara de prealmacenamiento, una cámara de mezcla, una cámara de reacción y una cámara de desechos.La clave para el control del flujo de fluido es el diseño FAST (que consta de membranas elásticas, palancas y bloques) ubicado en la cámara de prealmacenamiento y la cámara de mezcla.Como método accionado neumáticamente, el diseño FAST proporciona un control preciso del flujo de fluido, que incluye conmutación cerrado/abierto, dosificación versátil, liberación de fluido bajo demanda, operación confiable (p. ej., insensibilidad a la vibración ambiental) y almacenamiento a largo plazo.La plataforma FAST-POCT consta de cuatro capas: una capa de respaldo, una capa de película elástica, una capa de película plástica y una capa de cubierta, como se muestra en una vista ampliada en la Fig. 1b (también se muestra en detalle en las Figuras complementarias S1 y S2 ).Todos los canales y cámaras de transporte de fluidos (como las cámaras de reacción y de prealmacenamiento) están incrustados en sustratos de PLA (ácido poliláctico) que varían desde 0,2 mm (parte más delgada) hasta 5 mm de espesor.El material de la película elástica es un PDMS de 300 µm de espesor que se expande fácilmente cuando se aplica presión de aire debido a su “espesor delgado” y su bajo módulo de elasticidad (aproximadamente 2,25 MPa47).La capa de película de polietileno está hecha de tereftalato de polietileno (PET) con un espesor de 100 µm para proteger la película elástica de una deformación excesiva debido a la presión del aire.Correspondiente a las cámaras, la capa de sustrato tiene palancas conectadas a la capa de cubierta (hecha de PLA) mediante bisagras para controlar el flujo de líquido.La película elástica se pegó a la capa de soporte usando cinta adhesiva de doble cara (ARseal 90880) y se cubrió con una película de plástico.Se ensamblaron tres capas sobre un sustrato utilizando un diseño de clip en T en la capa de cobertura.La abrazadera en T tiene un espacio entre dos patas.Cuando se insertó el clip en la ranura, las dos patas se doblaron ligeramente, luego volvieron a su estado original y sujetaron firmemente la tapa y el respaldo a medida que pasaban por la ranura (Figura complementaria S1).Luego, las cuatro capas se ensamblan mediante conectores.
Diagrama esquemático de la plataforma que ilustra los distintos compartimentos funcionales y características de FAST.b Diagrama ampliado de la plataforma FAST-POCT.c Foto de la plataforma junto a una moneda de un cuarto de dólar estadounidense.
El mecanismo de trabajo de la plataforma FAST-POCT se muestra en la Figura 2. Los componentes clave son los bloques en la capa base y las bisagras en la capa de cubierta, lo que da como resultado un diseño de interferencia cuando las cuatro capas se ensamblan en forma de T. .Cuando no se aplica presión de aire (fig. 2a), el ajuste de interferencia hace que la bisagra se doble y deforme, y se aplica una fuerza de sellado a través de la palanca para presionar la película elástica contra el bloque, y se define el líquido en la cavidad del sello. como estado sellado.Cabe señalar que en este estado, la palanca está doblada hacia afuera, como se muestra en la vista lateral de la Fig. 2a.Cuando se suministra aire (Fig. 2b), la membrana elástica se expande hacia la cubierta y empuja la palanca hacia arriba, abriendo así un espacio entre la palanca y el bloque para que el fluido fluya hacia la siguiente cámara, que se define como un estado abierto. .Después de liberar la presión del aire, la palanca puede volver a su posición original y permanecer apretada debido a la elasticidad de la bisagra.Los vídeos de los movimientos de la palanca se presentan en la película complementaria S1.
A. Esquema y fotografías cerrado.En ausencia de presión, la palanca presiona la membrana contra el bloque y el líquido queda sellado.b En buen estado.Cuando se aplica presión, la membrana se expande y empuja la palanca hacia arriba, de modo que el canal se abre y el fluido puede fluir.c Determine el tamaño característico de la presión crítica.Las dimensiones características incluyen la longitud de la palanca (L), la distancia entre el control deslizante y la bisagra (l) y el grosor del saliente de la palanca (t).Fs es la fuerza de compactación en el punto B del acelerador. q es la carga uniformemente distribuida sobre la palanca.Tx* representa el par desarrollado por la palanca articulada.La presión crítica es la presión requerida para levantar la palanca y hacer que el fluido fluya.d Resultados teóricos y experimentales de la relación entre presión crítica y tamaño del elemento.Se realizaron n = 6 experimentos independientes y los datos se muestran como ± desviación estándar.Los datos sin procesar se presentan como archivos de datos sin procesar.
Se ha desarrollado un modelo analítico basado en la teoría de la viga para analizar la dependencia de la presión crítica Pc a la que se abre el espacio de los parámetros geométricos (por ejemplo, L es la longitud de la palanca, l es la distancia entre el bloque y el bisagra, S es la palanca. El área de contacto con el líquido t es el espesor de la protuberancia de la palanca, como se muestra en la Fig. 2c).Como se detalla en las Notas complementarias y la Figura complementaria S3, la brecha se abre cuando \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), donde Fs es el par \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) para eliminar las fuerzas asociadas con un ajuste de interferencia y hacer que la bisagra se doble.La respuesta experimental y el modelo analítico muestran buena concordancia (Fig. 2d), mostrando que la presión crítica Pc aumenta al aumentar t/l y disminuir L, lo que se explica fácilmente mediante el modelo de viga clásico, es decir, el par aumenta con t/Lift. .Por lo tanto, nuestro análisis teórico muestra claramente que la presión crítica se puede controlar efectivamente ajustando la longitud de la palanca L y la relación t/l, lo que proporciona una base importante para el diseño de la plataforma FAST-POCT.
La plataforma FAST-POCT proporciona dispensación multifuncional (que se muestra en la Figura 3a con recuadro y experimento), que es la característica más importante de un POCT exitoso, donde los fluidos pueden fluir en cualquier dirección y en cualquier orden (cascada, simultáneo, secuencial) o multicanal selectivo. dispensación.– función de dosificación.En la fig.3a(i) muestra un modo de dosificación en cascada en el que dos o más cámaras están en cascada usando bloques para separar los diversos reactivos y una palanca para controlar los estados abierto y cerrado.Cuando se aplica presión, el líquido fluye desde la cámara superior a la inferior en forma de cascada.Cabe señalar que las cámaras de cascada se pueden llenar con químicos húmedos o químicos secos como polvos liofilizados.En el experimento de la Fig. 3a (i), la tinta roja de la cámara superior fluye junto con el polvo de tinte azul (sulfato de cobre) hacia la segunda cámara y se vuelve azul oscuro cuando llega a la cámara inferior.También muestra la presión de control del fluido que se bombea.De manera similar, cuando una palanca está conectada a dos cámaras, pasa al modo de inyección simultánea, como se muestra en la fig.3a (ii), en el que el líquido se puede distribuir uniformemente en dos o más cámaras cuando se aplica presión.Dado que la presión crítica depende de la longitud de la palanca, la longitud de la palanca se puede ajustar para lograr un patrón de inyección secuencial como se muestra en la fig.3a(iii).Se conectó una palanca larga (con presión crítica Pc_long) a la cámara B y una palanca corta (con presión crítica Pc_short > Pc_long) a la cámara A. Como se aplicó la presión P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), solo el líquido en rojo puede fluir a la cámara B y cuando la presión se incrementó a P2 (> Pc_short), el líquido azul puede fluir a la cámara A. Este modo de inyección secuencial se aplica a diferentes líquidos que se transfieren a sus cámaras relacionadas en secuencia, lo cual es fundamental para un POCT exitoso. dispositivo.Se conectó una palanca larga (con presión crítica Pc_long) a la cámara B y una palanca corta (con presión crítica Pc_short > Pc_long) a la cámara A. Como se aplicó la presión P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), solo el líquido en rojo puede fluir a la cámara B y cuando la presión se incrementó a P2 (> Pc_short), el líquido azul puede fluir a la cámara A. Este modo de inyección secuencial se aplica a diferentes líquidos que se transfieren a sus cámaras relacionadas en secuencia, lo cual es fundamental para un POCT exitoso. dispositivo.La cámara principal (con la cámara B) y la cámara B, y la cámara (con la cámara Pc_short > Pc_long) con la cámara B. cámara A. Antes de usar la configuración P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) para usar, la tecnología más moderna puede ser La cámara B y el conjunto de datos instalado en P2 (> Pc_short) pueden conectarse a la cámara A. Este ajuste se realiza después de la operación. рименяется к различным жидкостям, последовательно перемещаемым в соответствующие камеры, что имеет решающее значение для шной POCT.Se conectó una palanca larga (con presión crítica Pc_long) a la cámara B y una palanca corta (con presión crítica Pc_short > Pc_long) a la cámara A. Cuando se aplica la presión P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), solo se resalta el líquido en rojo puede fluir hacia la cámara B, y cuando la presión se ha incrementado a P2 (> Pc_short), el líquido azul puede fluir hacia la cámara A. Este modo de inyección secuencial se aplica a diferentes fluidos transferidos secuencialmente a las respectivas cámaras, lo cual es crítico. para un POCT exitoso.dispositivo. La cámara de vídeo doble (cuadro de Pc_long) junto con la cámara B, y la cámara de vídeo corta (cuadro de Pc_short > Pc_long) junto con la cámara A.El brazo largo (presión crítica Pc_long) está conectado a la cámara B y el brazo corto (presión crítica Pc_short > Pc_long) está conectado a la cámara A.En la configuración de datos P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) en la cámara B, puede colocar el código binario en P2 (> Pc_short) в камеру A может поступать синяя жидкость.Cuando se aplica la presión P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), solo el líquido rojo puede ingresar a la cámara B, y cuando la presión aumenta a P2 (> Pc_short), el líquido azul puede ingresar a la cámara A. Este modo de inyección secuencial es adecuado para la transferencia secuencial de varios fluidos en las respectivas cámaras, lo cual es fundamental para el funcionamiento exitoso del dispositivo POCT.La Figura 3a(iv) demuestra el modo de inyección selectiva, donde la cámara principal tenía una palanca corta (con presión crítica Pc_short) y una palanca larga (con presión crítica Pc_long < Pc_short) que estaban conectadas a la cámara A y a la cámara B, respectivamente, además a otro canal de aire conectado a la cámara B. Para transferir el líquido a la cámara A primero, se aplicaron al dispositivo la presión P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) y P2 (P2 > P1) con P1 + P2 > Pc_short al mismo tiempo.La Figura 3a(iv) demuestra el modo de inyección selectiva, donde la cámara principal tenía una palanca corta (con presión crítica Pc_short) y una palanca larga (con presión crítica Pc_long < Pc_short) que estaban conectadas a la cámara A y a la cámara B, respectivamente, además a otro canal de aire conectado a la cámara B. Para transferir el líquido a la cámara A primero, se aplicaron al dispositivo la presión P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) y P2 (P2 > P1) con P1 + P2 > Pc_short al mismo tiempo.En la fig.3(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камер имела короткий (с критическим давлением Pc_short) и длинный рычаг (с крити ческим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A and камерой B соответственно.3a (iv) muestra el modo de inyección selectiva, en el que la cámara principal tenía una palanca corta (con presión crítica Pc_short) y una palanca larga (con presión crítica Pc_long < Pc_short), que estaban conectadas adicionalmente a la cámara A y a la cámara B, respectivamente.к другому воздушному каналу, соединенному с камерой B. Чтобы сначала передать жидкость в камеру A, к устройству одновременно давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) y P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short.a otro canal de aire conectado a la cámara B. Para transferir primero el fluido a la cámara A, se aplicaron simultáneamente al dispositivo las presiones P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) y P2 (P2 > P1), donde P1 + P2 > Pc_short. 3(iv) показан режим селективного впрыска, когда основная камера имеет короткий стержень (с критическим давлением Pc_short) и длинный стержен ь (с критическим давлением Pc_long < Pc_short), соединенные с камерой и камерой камерой соответственно, и в дополнение к другому воздушному каналу, подключенному к комнате B.La figura 3a(iv) muestra el modo de inyección selectiva cuando la cámara principal tiene un vástago corto (presión crítica Pc_corta) y un vástago largo (presión crítica Pc_larga < Pc_corta) conectados a la cámara A y a la cámara B respectivamente, y además de otro paso de aire, conectado a la habitación B.Así, P2 impide que el líquido entre en la cámara B;mientras tanto, la presión total P1 + P2 excedió la presión crítica para activar la palanca más corta conectada a la cámara A para permitir que el líquido fluya a la cámara A. Luego, cuando se requirió llenar la cámara B, solo necesitamos aplicar P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) en la cámara principal para activar la palanca larga y permitir que el líquido fluya a la cámara B. Se puede observar claramente desde el tiempo t = 3 s a 9 s que el líquido en la cámara A permaneció constante mientras aumentaba en la cámara B cuando se aplicó la presión P1.mientras tanto, la presión total P1 + P2 excedió la presión crítica para activar la palanca más corta conectada a la cámara A para permitir que el líquido fluya a la cámara A. Luego, cuando se requirió llenar la cámara B, solo necesitamos aplicar P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) en la cámara principal para activar la palanca larga y permitir que el líquido fluya a la cámara B. Se puede observar claramente desde el tiempo t = 3 s a 9 s que el líquido en la cámara A permaneció constante mientras aumentaba en la cámara B cuando se aplicó la presión P1.Para ello, utilice la cámara P1 + P2 previamente conectada a la cámara A, бы позволить жидкости течь в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно только применить P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) en la cámara actual, active la función de encendido y apagado en la cámara B. Puede encenderla durante un período de tiempo de 3 segundos 9 с жидкость в камере A оставалась постоянной, в то время как в камере она увеличивалась.Mientras tanto, la presión total P1 + P2 ha excedido la presión crítica para activar una palanca más corta conectada a la cámara A para permitir que el líquido fluya hacia la cámara A. Luego, cuando sea necesario llenar la cámara B, solo necesitamos aplicar P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) en la cámara principal para activar la palanca larga y dejar que el líquido fluya hacia la cámara B. Se puede observar claramente que entre t = 3 s y 9 s el líquido en la cámara A se mantuvo constante, mientras que en la cámara aumentó.B cuando se aplica la presión P1.Al mismo tiempo, la presión total P1 + P2 excede la presión crítica, accionando la palanca más corta que conecta la cámara A, permitiendo que el fluido fluya hacia la cámara A.Cuando llega el momento de llenar la cámara A, simplemente aplicamos P1 en la cámara principal y P2 en la cámara secundaria.De esta manera, el comportamiento del flujo se puede cambiar selectivamente entre las cámaras A y B. El comportamiento del flujo de los cuatro modos de distribución multifuncionales se puede encontrar en la película complementaria S2.
a Ilustración de asignación multifuncional, es decir (i) en cascada, (ii) simultánea, (iii) secuencial y (iv) selectiva.Las curvas representan el flujo de trabajo y los parámetros de estos cuatro modos de distribución.b Resultados de pruebas de almacenamiento a largo plazo en agua desionizada y etanol.Se realizaron n = 5 experimentos independientes y los datos se muestran como ± sd c.Demostraciones de pruebas de estabilidad cuando el dispositivo FAST y el dispositivo de válvula capilar (CV) estaban en estados (i) estáticos y (ii) vibratorios.(iii) Volumen versus tiempo para dispositivos FAST y CV en varias frecuencias angulares.d Publicación de resultados de pruebas bajo demanda para (i) dispositivo FAST y (ii) dispositivo CV.(iii) Relación entre volumen y tiempo para dispositivos FAST y CV que utilizan el modo de presión intermitente.Todas las barras de escala, 1 cm.Los datos sin procesar se proporcionan como archivos de datos sin procesar.
El almacenamiento a largo plazo de reactivos es otra característica importante de un dispositivo POCT exitoso que permitirá que personal no capacitado manipule múltiples reactivos.Si bien muchas tecnologías han demostrado su potencial para el almacenamiento a largo plazo (por ejemplo, 35 microdispensadores, 48 blisters y 49 stick packs), se requiere un compartimento receptor dedicado para acomodar el paquete, lo que aumenta el costo y la complejidad;además, estos mecanismos de almacenamiento no permiten la dispensación bajo demanda y dan lugar a un desperdicio de reactivos debido a los restos en el embalaje.La capacidad de almacenamiento a largo plazo se verificó mediante la realización de una prueba de vida acelerada utilizando material PMMA mecanizado por CNC debido a su ligera rugosidad y resistencia a la permeación de gas (Figura complementaria S5).El aparato de prueba se llenó con agua desionizada (agua desionizada) y etanol al 70% (simulando reactivos volátiles) a 65°C durante 9 días.Tanto el agua desionizada como el etanol se almacenaron utilizando papel de aluminio para bloquear el acceso desde arriba.Para calcular el equivalente en tiempo real se utilizó la ecuación de Arrhenius y la energía de activación de penetración reportada en la literatura50,51.En la fig.3b muestra los resultados de pérdida de peso promedio para 5 muestras almacenadas a 65°C durante 9 días, equivalente a 0,30% para agua desionizada y 0,72% para etanol al 70% durante 2 años a 23°C.
En la fig.3c muestra la prueba de vibración.Dado que la válvula capilar (CV) es el método de manipulación de fluidos más popular entre los dispositivos POCT28,29 existentes, se utilizó un dispositivo CV de 300 µm de ancho y 200 µm de profundidad para comparar.Se puede observar que cuando ambos dispositivos permanecen estacionarios, el fluido en la plataforma FAST-POCT se sella y el fluido en el dispositivo CV se bloquea debido a la expansión repentina del canal, lo que reduce las fuerzas capilares.Sin embargo, a medida que aumenta la frecuencia angular del vibrador orbital, el fluido en la plataforma FAST-POCT permanece sellado, pero el fluido en el dispositivo CV fluye hacia la cámara inferior (consulte también la película complementaria S3).Esto sugiere que las bisagras deformables de la plataforma FAST-POCT pueden aplicar una fuerte fuerza mecánica al módulo para cerrar herméticamente el líquido en la cámara.Sin embargo, en los dispositivos CV, el líquido se retiene debido al equilibrio entre las fases sólida, aérea y líquida, lo que genera inestabilidad, y las vibraciones pueden alterar el equilibrio y provocar un comportamiento inesperado del flujo.La ventaja de la plataforma FAST-POCT es que proporciona una funcionalidad confiable y evita fallas en presencia de vibraciones que generalmente ocurren durante la entrega y operación.
Otra característica importante de la plataforma FAST-POCT es su publicación bajo demanda, que es un requisito clave para el análisis cuantitativo.En la fig.3d compara el lanzamiento bajo demanda de la plataforma FAST-POCT y el dispositivo CV.De la fig.3d (iii) vemos que el dispositivo FAST responde rápidamente a la señal de presión.Cuando se aplicó presión a la plataforma FAST-POCT, el fluido fluyó, cuando se liberó la presión, el flujo se detuvo inmediatamente (Fig. 3d (i)).Esta acción puede explicarse por el rápido retorno elástico de la bisagra, que presiona la palanca contra el bloque, cerrando la cámara.Sin embargo, el líquido continuó fluyendo en el dispositivo CV, lo que eventualmente resultó en un volumen de líquido inesperado de aproximadamente 100 µl después de que se liberó la presión (Figura 3d (ii) y Película complementaria S4).Esto puede explicarse por la desaparición del efecto de fijación capilar tras la humectación completa del CV después de la primera inyección.
La capacidad de manejar líquidos de diferente humectabilidad y viscosidad en el mismo dispositivo sigue siendo un desafío para las aplicaciones POCT.Una mala humectabilidad puede provocar fugas u otros comportamientos de flujo inesperados en los canales, y a menudo se requieren equipos auxiliares como mezcladores de vórtice, centrífugas y filtros para preparar líquidos altamente viscosos 52 .Probamos la relación entre la presión crítica y las propiedades del fluido (con un amplio rango de humectabilidad y viscosidad).Los resultados se muestran en la Tabla 1 y el Video S5.Se puede observar que en la cámara se pueden sellar líquidos de diferente humectabilidad y viscosidad, y cuando se aplica presión, incluso líquidos con una viscosidad de hasta 5500 cP se pueden transferir a la cámara adyacente, lo que permite detectar muestras con alta viscosidad (es decir, esputo, una muestra muy viscosa utilizada para el diagnóstico de enfermedades respiratorias).
Combinando los dispositivos dispensadores multifuncionales anteriores, se puede desarrollar una amplia gama de dispositivos POCT basados en FAST.En la Figura 1 se muestra un ejemplo. La planta contiene una cámara de prealmacenamiento, una cámara de mezcla, una cámara de reacción y una cámara de desechos.Los reactivos pueden almacenarse en la cámara de prealmacenamiento durante períodos prolongados y luego descargarse en la cámara de mezcla.Con la presión adecuada, los reactivos mezclados se pueden transferir selectivamente a una cámara de residuos o a una cámara de reacción.
Debido a que la detección por PCR es el estándar de oro para detectar patógenos como H1N1 y COVID-19 e implica múltiples pasos de reacción, utilizamos la plataforma FAST-POCT para la detección por PCR como aplicación.En la fig.4 muestra el proceso de prueba de PCR utilizando la plataforma FAST-POCT.Primero, el reactivo de elución, el reactivo de microperlas magnéticas, la solución de lavado A y la solución de lavado W se pipetearon en las cámaras de almacenamiento previo E, M, W1 y W2, respectivamente.Las etapas de la adsorción de ARN se muestran en la fig.4a y son los siguientes: (1) cuando se aplica la presión P1 (=0,26 bar), la muestra pasa a la cámara M y se descarga a la cámara de mezcla.(2) La presión de aire P2 (= 0,12 bar) se suministra a través del puerto A conectado al fondo de la cámara de mezcla.Aunque varios métodos de mezcla han demostrado su potencial para mezclar líquidos en plataformas POCT (por ejemplo, mezcla en serpentina 53, mezcla aleatoria 54 y mezcla por lotes 55), su eficiencia y eficacia de mezcla aún no son satisfactorias.Adopta el método de mezcla de burbujas, en el que se introduce aire en el fondo de la cámara de mezcla para crear burbujas en el líquido, después de lo cual el potente vórtice puede lograr una mezcla completa en segundos.Se llevaron a cabo experimentos de mezcla de burbujas y los resultados se presentan en la Figura complementaria S6.Se puede observar que cuando se aplica una presión de 0,10 bar, la mezcla completa tarda unos 8 segundos.Aumentando la presión a 0,20 bar se consigue una mezcla completa en aproximadamente 2 segundos.Los métodos para calcular la eficiencia de la mezcla se presentan en la sección Métodos.(3) Utilice un imán de rubidio para extraer las perlas, luego presurice P3 (= 0,17 bar) a través del puerto P para mover los reactivos a la cámara de desechos.En la fig.4b,c muestra los pasos de lavado para eliminar impurezas de la muestra de la siguiente manera: (1) La solución de lavado A de la cámara W1 se descarga en la cámara de mezcla a presión P1.(2) Luego realice el proceso de mezcla de burbujas.(3) La solución de lavado A se transfiere a la cámara de líquido residual y el imán extrae las microperlas de la cámara de mezcla.El lavado W (Fig. 4c) fue similar al lavado A (Fig. 4b).Cabe señalar que cada etapa de lavado A y W se realizó dos veces.La Figura 4d muestra los pasos de elución para eluir el ARN de las perlas;Los pasos de elución e introducción de la mezcla son los mismos que los pasos de adsorción y lavado de ARN descritos anteriormente.A medida que los reactivos de elución se transfieren a la cámara de reacción de PCR bajo las presiones P3 y P4 (=0,23 bar), se alcanza la presión crítica para sellar el brazo de la cámara de reacción de PCR.De manera similar, la presión P4 también ayuda a sellar el paso a la cámara de desechos.Por lo tanto, todos los reactivos de elución se distribuyeron uniformemente entre las cuatro cámaras de reacción de PCR para iniciar las reacciones de PCR múltiples.El procedimiento anterior se presenta en la película complementaria T6.
En el paso de adsorción de ARN, la muestra se introduce en la entrada M y se inyecta en la cámara de mezcla junto con la solución de perlas previamente almacenada.Después de mezclar y retirar los gránulos, los reactivos se distribuyen en la cámara de residuos.b y c pasos de lavado, introduzca varios reactivos de lavado previamente almacenados en la cámara de mezcla y, después de mezclar y retirar las perlas, transfiera los reactivos a la cámara de líquido residual.d Paso de elución: después de introducir los reactivos de elución, mezclar y extraer las perlas, los reactivos se transfieren a la cámara de reacción de PCR.Las curvas muestran el flujo de trabajo y los parámetros relacionados de las distintas etapas.La presión es la presión ejercida a través de las cámaras individuales.El volumen es el volumen de líquido en la cámara de mezcla.Todas las barras de escala son de 1 cm.Los datos sin procesar se proporcionan como archivos de datos sin procesar.
Se realizó un procedimiento de prueba de PCR y la Figura complementaria S7 presenta perfiles térmicos que incluyen 20 minutos de tiempo de transcripción inversa y 60 minutos de tiempo de ciclado térmico (95 y 60 °C), siendo un ciclo térmico de 90 s (Película complementaria S7)..FAST-POCT requiere menos tiempo para completar un ciclo térmico (90 segundos) que la RT-PCR convencional (180 segundos para un ciclo térmico).Esto puede explicarse por la alta relación superficie-volumen y la baja inercia térmica de la cámara de reacción de micro-PCR.La superficie de la cámara es de 96,6 mm2 y el volumen de la cámara es de 25 mm3, lo que hace que la relación superficie-volumen sea aproximadamente 3,86.Como se ve en la Figura complementaria S10, el área de prueba de PCR de nuestra plataforma tiene una ranura en el panel posterior, lo que hace que la parte inferior de la cámara de PCR tenga un grosor de 200 µm.Se adjunta una almohadilla elástica térmicamente conductora a la superficie calefactora del controlador de temperatura, lo que garantiza un contacto estrecho con la parte posterior de la caja de prueba.Esto reduce la inercia térmica de la plataforma y mejora la eficiencia de calefacción/refrigeración.Durante el ciclo térmico, la parafina incrustada en la plataforma se funde y fluye hacia la cámara de reacción de PCR, actuando como sellador para evitar la evaporación del reactivo y la contaminación ambiental (consulte la película complementaria S8).
Todos los procesos de detección de PCR descritos anteriormente se automatizaron completamente utilizando un instrumento FAST-POCT hecho a medida, que consta de una unidad de control de presión programada, una unidad de extracción magnética, una unidad de control de temperatura y una unidad de captura y procesamiento de señales fluorescentes.Es de destacar que utilizamos la plataforma FAST-POCT para el aislamiento de ARN y luego utilizamos las muestras de ARN extraídas para reacciones de PCR utilizando el sistema FAST-POCT y el sistema de PCR de escritorio para comparar.Los resultados fueron casi los mismos que se muestran en la Figura complementaria S8.El operador realiza una tarea sencilla: introduce la muestra en la cámara M e inserta la plataforma en el instrumento.Los resultados de las pruebas cuantitativas están disponibles en aproximadamente 82 minutos.Puede encontrar información detallada sobre las herramientas FAST-POCT en la figura complementaria.C9, C10 y C11.
La influenza causada por los virus influenza A (IAV), B (IBV), C (ICV) y D (IDV) es un fenómeno global común.De estos, el IAV y el IBV son responsables de los casos más graves y de las epidemias estacionales, infectando entre el 5% y el 15% de la población mundial, causando entre 3 y 5 millones de casos graves y entre 290.000 y 650.000 muertes al año.Enfermedades respiratorias56,57.El diagnóstico temprano de IAV e IB es esencial para reducir la morbilidad y la carga económica asociada.Entre las técnicas de diagnóstico disponibles, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se considera la más sensible, específica y precisa (>99%)58,59.Entre las técnicas de diagnóstico disponibles, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se considera la más sensible, específica y precisa (>99%)58,59.Среди доступных доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается наиболее чув ствительной, специфичной и точной (> 99%)58,59.Entre los métodos de diagnóstico disponibles, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se considera el más sensible, específico y preciso (>99%)58,59. Los métodos de diagnóstico disponibles se utilizan para la transcripción de documentos (ОТ-ПЦР) ительной, специфичной и точной (>99%)58,59.De los métodos de diagnóstico disponibles, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se considera el más sensible, específico y preciso (>99%)58,59.Sin embargo, los métodos tradicionales de RT-PCR requieren pipetear, mezclar, dispensar y transferir fluidos repetidamente, lo que limita su uso por parte de profesionales en entornos con recursos limitados.En este caso, se utilizó la plataforma FAST-POCT para la detección por PCR de IAV e IBV, respectivamente, para obtener su límite inferior de detección (LOD).Además, se han multiplexado IAV e IBV para discriminar entre diferentes patotipos entre especies, lo que proporciona una plataforma prometedora para el análisis genético y la capacidad de tratar la enfermedad con precisión.
En la fig.5a muestra los resultados de la prueba de PCR del VHA utilizando 150 µl de ARN viral purificado como muestra.En la fig.5a(i) muestra que a una concentración de HAV de 106 copias/ml, la intensidad de fluorescencia (ΔRn) puede alcanzar 0,830, y cuando la concentración se reduce a 102 copias/ml, ΔRn todavía puede alcanzar 0,365, lo que corresponde a una cifra superior a esa. del grupo de control negativo vacío (0,002), aproximadamente 100 veces mayor.Para la cuantificación basada en seis experimentos independientes, se generó una curva de calibración lineal entre la concentración logarítmica y el umbral del ciclo (Ct) de IAV (Fig. 5a (ii)), R2 = 0,993, con un rango de 102 a 106 copias/ml.los resultados concuerdan con los métodos convencionales de RT-PCR.En la fig.5a(iii) muestra imágenes fluorescentes de los resultados de las pruebas después de 40 ciclos de la plataforma FAST-POCT.Descubrimos que la plataforma FAST-POCT puede detectar VHA tan solo 102 copias/ml.Sin embargo, el método tradicional no tiene un valor Ct de 102 copias/ml, lo que lo convierte en un LOD de aproximadamente 103 copias/ml.Nuestra hipótesis es que esto puede deberse a la alta eficiencia del mezclado de burbujas.Se realizaron experimentos de prueba de PCR en ARN de IAV purificado para evaluar varios métodos de mezcla, incluida la mezcla con agitación (el mismo método de mezcla que en la operación de RT-PCR convencional), la mezcla con viales (este método, 3 s a 0,12 bar) y sin mezcla como grupo de control. ..Los resultados se pueden encontrar en la Figura complementaria S12.Se puede observar que a una concentración de ARN más alta (106 copias/mL), los valores de Ct de los diferentes métodos de mezcla son casi los mismos que para la mezcla con burbujas.Cuando la concentración de ARN cayó a 102 copias/mL, la mezcla de agitación y los controles no tenían valores de Ct, mientras que el método de mezcla de burbujas todavía dio un valor de Ct de 36,9, que estaba por debajo del umbral de Ct de 38. Los resultados muestran una característica de mezcla dominante. vesículas, lo que también se ha demostrado en otra literatura, lo que también puede explicar por qué la sensibilidad de la plataforma FAST-POCT es ligeramente mayor que la RT-PCR convencional.En la fig.5b muestra los resultados del análisis por PCR de muestras de ARN de IBV purificadas que varían de 101 a 106 copias/ml.Los resultados fueron similares a la prueba IAV, logrando un R2 = 0,994 y un LOD de 102 copias/mL.
un análisis por PCR del virus de la influenza A (IAV) con concentraciones de IAV que oscilan entre 106 y 101 copias/ml utilizando tampón TE como control negativo (NC).(i) Curva de fluorescencia en tiempo real.(ii) Curva de calibración lineal entre la concentración logarítmica de ARN de IAV y el umbral del ciclo (Ct) para los métodos de prueba FAST y convencionales.(iii) Imagen fluorescente IAV FAST-POCT después de 40 ciclos.b, detección por PCR del virus de la influenza B (IBV) con (i) espectro de fluorescencia en tiempo real.(ii) Curva de calibración lineal y (iii) Imagen de fluorescencia FAST-POCT IBV después de 40 ciclos.El límite inferior de detección (LOD) para IAV e IBV utilizando la plataforma FAST-POCT fue de 102 copias/ml, que es más bajo que los métodos convencionales (103 copias/ml).c Resultados de pruebas multiplex para IAV e IBV.Se utilizó GAPDH como control positivo y tampón TE como control negativo para evitar una posible contaminación y amplificación de fondo.Se pueden distinguir cuatro tipos de muestras diferentes: (1) muestras negativas únicamente para GAPDH (“IAV-/IBV-”);(2) infección por IAV (“IAV+/IBV-”) con IAV y GAPDH;(3) infección por IBV (“IAV-/IBV+”) con IBV y GAPDH;(4) Infección por IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) con IAV, IBV y GAPDH.La línea de puntos representa la línea de umbral.Se realizaron n = 6 experimentos biológicamente independientes, los datos se muestran como ± desviación estándar.Los datos sin procesar se presentan como archivos de datos sin procesar.
En la fig.5c muestra los resultados de la prueba de multiplexación para IAV/IBV.Aquí, se usó lisado de virus como solución de muestra en lugar de ARN purificado, y se agregaron cuatro cebadores para IAV, IBV, GAPDH (control positivo) y tampón TE (control negativo) a cuatro cámaras de reacción diferentes de la plataforma FAST-POCT.Aquí se utilizan controles positivos y negativos para evitar una posible contaminación y una mejora del fondo.Las pruebas se dividieron en cuatro grupos: (1) muestras negativas para GAPDH (“IAV-/IBV-”);(2) infectados por IAV (“IAV+/IBV-”) versus IAV y GAPDH;(3) IBV-.infectado (“IAV-”) -/IBV+”) IBV y GAPDH;(4) Infección por IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) con IAV, IBV y GAPDH.En la fig.5c muestra que cuando se aplicaron muestras negativas, la intensidad de fluorescencia ΔRn de la cámara de control positivo fue 0,860, y la ΔRn de IAV e IBV fue similar a la del control negativo (0,002).Para los grupos IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ e IAV+/IBV+, las cámaras IAV/GAPDH, IBV/GAPDH e IAV/IBV/GAPDH mostraron una intensidad de fluorescencia significativa, respectivamente, mientras que las otras cámaras incluso mostraron una intensidad de fluorescencia en un fondo. nivel de 40 después del ciclo térmico.A partir de las pruebas anteriores, la plataforma FAST-POCT mostró una especificidad sobresaliente y nos permitió patotipar simultáneamente diferentes virus de la influenza.
Para validar la aplicabilidad clínica de FAST-POCT, analizamos 36 muestras clínicas (muestras de hisopos nasales) de pacientes con BI (n = 18) y controles sin BI (n = 18) (Figura 6a).La información del paciente se presenta en la Tabla complementaria 3. El estado de infección por BI se confirmó de forma independiente y el protocolo del estudio fue aprobado por el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).Cada muestra de pacientes se dividió en dos categorías.Uno se procesó utilizando FAST-POCT y el otro se procesó utilizando un sistema de PCR de escritorio (SLAN-96P, China).Ambos ensayos utilizan los mismos kits de purificación y detección.En la fig.6b muestra los resultados de FAST-POCT y PCR de transcripción inversa convencional (RT-PCR).Comparamos la intensidad de fluorescencia (FAST-POCT) con -log2 (Ct), donde Ct es el umbral del ciclo para RT-PCR convencional.Hubo buen acuerdo entre los dos métodos.FAST-POCT y RT-PCR mostraron una fuerte correlación positiva con un valor del índice de Pearson (r) de 0,90 (Figura 6b).Luego evaluamos la precisión diagnóstica de FAST-POCT.Las distribuciones de intensidad de fluorescencia (FL) para muestras positivas y negativas se proporcionaron como una medida analítica independiente (Fig. 6c).Los valores de FL fueron significativamente más altos en pacientes con BI que en los controles (****P = 3,31 × 10-19; prueba t de dos colas) (Fig. 6d).A continuación, se trazaron las curvas de características operativas del receptor (ROC) del IBV.Descubrimos que la precisión diagnóstica fue muy buena, con un área bajo la curva de 1 (Fig. 6e).Tenga en cuenta que debido al pedido obligatorio de mascarillas en China debido a la COVID-19 a partir de 2020, no hemos identificado pacientes con EII, por lo que todas las muestras clínicas positivas (es decir, muestras de hisopos nasales) fueron solo para IBV.
Diseño de estudios clínicos.Se analizaron un total de 36 muestras, incluidas 18 muestras de pacientes y 18 controles sin influenza, utilizando la plataforma FAST-POCT y RT-PCR convencional.b Evalúe la coherencia analítica entre FAST-POCT PCR y RT-PCR convencional.Los resultados se correlacionaron positivamente (Pearson r = 0,90).c Niveles de intensidad de fluorescencia en 18 pacientes con BI y 18 controles.d En pacientes con BI (+), los valores de FL fueron significativamente más altos que en el grupo de control (-) (****P = 3,31 × 10-19; prueba t de dos colas; n = 36).Para cada gráfico cuadrado, el marcador negro en el centro representa la mediana, y las líneas inferior y superior del cuadro representan los percentiles 25 y 75, respectivamente.Los bigotes se extienden hasta los puntos de datos mínimo y máximo, que no se consideran valores atípicos.e curva ROC.La línea de puntos d representa el valor umbral estimado a partir del análisis ROC.El AUC para IBV es 1. Los datos sin procesar se proporcionan como archivos de datos sin procesar.
En este artículo presentamos FAST, que tiene las características requeridas para un POCT ideal.Las ventajas de nuestra tecnología incluyen: (1) Dosificación versátil (en cascada, simultánea, secuencial y selectiva), liberación bajo demanda (liberación rápida y proporcional de la presión aplicada) y operación confiable (vibración a 150 grados) (2) almacenamiento a largo plazo (2 años de pruebas aceleradas, pérdida de peso de alrededor del 0,3%);(3) la capacidad de trabajar con líquidos con un amplio rango de humectabilidad y viscosidad (viscosidad hasta 5500 cP);(4) Económico (el costo estimado del material del dispositivo de PCR FAST-POCT es de aproximadamente 1 dólar estadounidense).Combinando dispensadores multifuncionales, se demostró y aplicó una plataforma FAST-POCT integrada para la detección por PCR de los virus de la influenza A y B.FAST-POCT sólo tarda 82 minutos.Las pruebas clínicas con 36 muestras de hisopos nasales mostraron buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).Las pruebas clínicas con 36 muestras de hisopos nasales mostraron buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).Pruebas clínicas con 36 máscaras de pestañas que se pueden utilizar con una intensidad intensa de fluorescencia estándar ОТ-ПЦ Р (коэффициенты Пирсона > 0,9).Las pruebas clínicas con 36 muestras de hisopos nasales mostraron una buena concordancia con la intensidad de fluorescencia de la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9).RT-PCR Instalación clínica de 36 máscaras que se pueden utilizar según el estándar OT-P ЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Las pruebas clínicas de 36 muestras de hisopos nasales mostraron una buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la RT-PCR estándar (coeficiente de Pearson > 0,9).Paralelamente a este trabajo, varios métodos bioquímicos emergentes (p. ej., ciclo térmico del plasma, inmunoensayos sin amplificación y ensayos de funcionalización de nanocuerpos) han demostrado su potencial en POCT.Sin embargo, debido a la falta de una plataforma POCT robusta y totalmente integrada, estos métodos inevitablemente requieren procedimientos de preprocesamiento separados (por ejemplo, aislamiento de ARN44, incubación45 y lavado46), lo que complementa aún más el trabajo actual con estos métodos para implementar funciones POCT avanzadas con los parámetros requeridos.rendimiento de salida de respuesta de búsqueda.En este trabajo, aunque la bomba de aire utilizada para activar la válvula FAST es lo suficientemente pequeña como para integrarse en un instrumento de mesa (Fig. S9, S10), aún consume una cantidad significativa de energía y genera ruido.En principio, las bombas neumáticas de formato más pequeño pueden sustituirse por otros medios, como el uso de fuerza electromagnética o el accionamiento con los dedos.Otras mejoras pueden incluir, por ejemplo, la adaptación de kits para ensayos bioquímicos diferentes y específicos, utilizando nuevos métodos de detección que no requieran sistemas de calentamiento/enfriamiento, proporcionando así una plataforma POCT sin herramientas para aplicaciones de PCR.Creemos que, dado que la plataforma FAST proporciona una forma de manipular líquidos, creemos que la tecnología FAST propuesta presenta el potencial de crear una plataforma común no solo para pruebas biomédicas, sino también para monitoreo ambiental, pruebas de calidad de alimentos y síntesis de materiales y medicamentos. ..
La recolección y el uso de muestras de hisopos nasales humanos han sido aprobados por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang (IIT20220330B).Se recolectaron 36 muestras de hisopos nasales, de los cuales 16 adultos < 30 años, 7 adultos > 40 años y 19 hombres y 17 mujeres.Se recolectaron 36 muestras de hisopos nasales, de los cuales 16 adultos < 30 años, 7 adultos > 40 años y 19 hombres y 17 mujeres.Cada uno tiene 36 máscaras y 16 estrellas < 30 estrellas, 7 estrellas 40 estrellas 17 mujeres.Se recogieron treinta y seis muestras de hisopos nasales de 16 adultos <30 años, 7 adultos mayores de 40 años, 19 hombres y 17 mujeres..Los datos demográficos se presentan en la Tabla complementaria 3. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.Se sospechaba que todos los participantes tenían influenza y se les hizo la prueba voluntariamente y sin compensación.
La base y la tapa FAST están hechas de ácido poliláctico (PLA) e impresas con la impresora 3D Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).La cinta de doble cara se adquirió de Adhesives Research, Inc. Modelo 90880. La película de PET de 100 µm de espesor se adquirió de McMaster-Carr.Tanto el adhesivo como la película de PET se cortaron usando el cortador Silhouette Cameo 2 de Silhouette America, Inc. La película elástica está hecha de material PDMS mediante moldeo por inyección.En primer lugar, se cortó un marco de PET de 200 µm de espesor utilizando un sistema láser y se pegó a una lámina de PMMA de 3 mm de espesor utilizando cinta adhesiva de doble cara de 100 µm.Luego se vertió el precursor de PDMS (Sylgard 184; Parte A: Parte B = 10:1, Dow Corning) en el molde y se usó una varilla de vidrio para eliminar el exceso de PDMS.Después de curar a 70°C durante 3 horas, la película de PDMS de 300 µm de espesor se pudo despegar del molde.
Las fotografías para una distribución versátil, publicación bajo demanda y un rendimiento confiable se toman con una cámara de alta velocidad (Sony AX700 1000 fps).El agitador orbital utilizado en la prueba de confiabilidad se adquirió de SCILOGEX (SCI-O180).La presión del aire es generada por un compresor de aire y se utilizan varios reguladores de presión digitales de precisión para ajustar el valor de la presión.El proceso de prueba del comportamiento del flujo es el siguiente.Se inyectó una cantidad predeterminada de fluido en el dispositivo de prueba y se utilizó una cámara de alta velocidad para registrar el comportamiento del flujo.Luego se tomaron imágenes fijas de vídeos del comportamiento del flujo en momentos fijos y el área restante se calculó utilizando el software Image-Pro Plus, que luego se multiplicó por la profundidad de la cámara para calcular el volumen.Los detalles del sistema de prueba del comportamiento del flujo se pueden encontrar en la Figura complementaria S4.
Inyecte 50 l de microperlas y 100 l de agua desionizada en el dispositivo de mezcla del vial.Se tomaron fotografías de rendimiento mixto con una cámara de alta velocidad cada 0,1 segundos a presiones de 0,1 bar, 0,15 bar y 0,2 bar.La información de píxeles durante el proceso de fusión se puede obtener de estas imágenes utilizando un software de procesamiento de fotografías (Photoshop CS6).Y la eficiencia de la mezcla se puede lograr con la siguiente Ecuación 53.
donde M es la eficiencia de mezcla, N es el número total de píxeles de la muestra y ci y \(\bar{c}\) son las concentraciones normalizadas y normalizadas esperadas.La eficiencia de la mezcla varía de 0 (0%, sin mezclar) a 1 (100%, completamente mezclado).Los resultados se muestran en la Figura complementaria S6.
Kit de RT-PCR en tiempo real para IAV e IBV, incluidas muestras de ARN de IAV e IBV (n.º de catálogo RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, China), tampón Tris-EDTA (n.º de tampón TE B541019 , Sangon Biotech, China), el kit de purificación de ARN de control positivo (n.º de pieza Z-ME-0010, Liferiver, China) y la solución GAPDH (n.º de pieza M591101, Sangon Biotech, China) están disponibles comercialmente.El kit de purificación de ARN incluye un tampón de unión, lavado A, lavado W, eluyente, microperlas magnéticas y un soporte acrílico.Los kits de RT-PCR en tiempo real para IAV e IBV incluyen una mezcla de detección de PCR de ácido nucleico de IFVA y una enzima para RT-PCR.Agregue 6 l de AcrylCarrier y 20 l de perlas magnéticas a 500 l de solución tampón de unión, agite bien y luego prepare la solución de perlas.Añadir 21 ml de etanol a los lavados A y W, agitar bien para obtener soluciones de los lavados A y W, respectivamente.Luego, se agregaron 18 µl de mezcla de PCR fluorescente con ácido nucleico IFVA y 1 µl de enzima RT-PCR a 1 µl de solución TE, se agitó y se centrifugó durante varios segundos, obteniendo 20 µl de cebadores IAV e IBV.
Siga el siguiente procedimiento de purificación de ARN: (1) Adsorción de ARN.Pipetee 526 l de la solución del sedimento en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y agregue 150 l de muestra, luego agite manualmente el tubo hacia arriba y hacia abajo 10 veces.Transfiera 676 l de la mezcla a la columna de afinidad y centrifugue a 1,88 x 104 g durante 60 segundos.Luego se descartan los drenajes posteriores.(2) La primera etapa del lavado.Añadir 500 l de solución de lavado A a la columna de afinidad, centrifugar a 1,88 x 104 g durante 40 s y desechar la solución gastada.Este proceso de lavado se repitió dos veces.(3) la segunda etapa del lavado.Añadir 500 µl de solución de lavado W a la columna de afinidad, centrifugar a 1,88 x 104 g durante 15 s y desechar la solución gastada.Este proceso de lavado se repitió dos veces.(4) Elución.Añadir 200 l de eluido a la columna de afinidad y centrifugar a 1,88 x 104 g durante 2 min.(5) RT-PCR: el eluato se inyectó en 20 µl de la solución de cebador en un tubo de PCR, luego el tubo se colocó en un aparato de prueba de PCR en tiempo real (SLAN-96P) para llevar a cabo el proceso de RT-PCR.Todo el proceso de detección dura aproximadamente 140 minutos (20 minutos para la purificación del ARN y 120 minutos para la detección por PCR).
Se agregaron preliminarmente 526 µl de solución de perlas, 1000 µl de solución de lavado A, 1000 µl de solución de lavado W, 200 µl de eluido y 20 µl de solución de cebador y se almacenaron en las cámaras M, W1, W2, E y cámaras de detección de PCR.Montaje de plataforma.Luego, se pipetearon 150 µl de la muestra en la cámara M y se insertó la plataforma FAST-POCT en el instrumento de prueba que se muestra en la Figura complementaria S9.Después de unos 82 minutos, los resultados de la prueba estuvieron disponibles.
A menos que se indique lo contrario, todos los resultados de las pruebas se presentan como media ± DE después de un mínimo de seis réplicas utilizando únicamente la plataforma FAST-POCT y muestras biológicamente independientes.No se excluyeron datos del análisis.Los experimentos no son aleatorios.Los investigadores no ignoraron las tareas grupales durante el experimento.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Nature Research Report vinculado a este artículo.
Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en Información complementaria.Este artículo proporciona los datos originales.
Chagla, Z. & Madhukar, P. Los refuerzos de COVID-19 en los países ricos retrasarán las vacunas para todos.Chagla, Z. & Madhukar, P. Los refuerzos de COVID-19 en los países ricos retrasarán las vacunas para todos.Chagla, Z. y Madhukar, P. Las dosis de refuerzo de COVID-19 en los países ricos retrasarán las vacunas para todos.Chagla, Z. y Madhukar, P. La revacunación contra la COVID-19 en los países ricos retrasará la vacunación para todos.Medicina nacional.27, 1659–1665 (2021).
Fausto, L. et al.Pruebas de SARS-CoV-2 en países de ingresos bajos y medios: disponibilidad y asequibilidad en el sector sanitario privado.infección microbiana.22, 511–514 (2020).
Organización Mundial de la Salud.Prevalencia e incidencia globales de infecciones de transmisión sexual curables seleccionadas: una revisión y estimaciones.Ginebra: OMS, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM y cols.Múltiples tiras reactivas de flujo lateral moldeadas en 2D.Aplicación CULO.alma mater.Inter de Milán.1, 124-129 (2009).
Schilling, KM y cols.Dispositivo de análisis de microfluidos basado en papel completamente cerrado.ano.Químico.84, 1579-1585 (2012).
Lapenter, N. y col.La inmunocromatografía competitiva en papel junto con electrodos modificados con enzimas permite la monitorización inalámbrica y la determinación electroquímica de la cotinina urinaria.Sensores 21, 1659 (2021).
Zhu, X. y col.Cuantificación de biomarcadores de enfermedades con una plataforma de fluido lateral versátil integrada en nanozimas utilizando un glucómetro.sensor biológico.Bioelectrónica.126, 690–696 (2019).
Boo, S. y col.Tira reactiva de embarazo para la detección de bacterias patógenas utilizando nanoflores híbridas de concanavalina A-gonadotropina coriónica humana-Cu3(PO4)2, separación magnética y lectura de teléfonos inteligentes.Microordenador.Revista.185, 464 (2018).